Fluoreszierende Samen

Nein! Ihr seid hier nicht bei einem Bericht über Science-Fiction-Schmuddelfilme,

sondern wie immer beim Freitagsbericht von moi.

Diese Woche stand tatsächlich sehr viel Arbeit und sehr wenig Sonstiges an.

Allerdings habe ich ein paar coole Bilder von rot fluoreszierenden Samen,

also dafür lohnt es sich doch dranzubleiben.

 

Fangen wir trotzdem mit dem Sonstigen an!

Und zwar werde ich tatsächlich mit meinem guten Freund und Kupferstecher T. Wendel an einem

Marathon teilnehmen! Die Idee dafür kam von Herrn Wendel höchstpersönlich!

Wir werden dort  als 2er Intim antreten und uns die Strecke aufteilen, so dass jeder einen Halbmarathon läuft.

Das Event findet am 05. April 2020 statt und nennt sich "Marathon Deutsche Weinstraße".

Start und Ziel werden in Bockenheim sein, am Haus der Deutschen Weinstraße.

Bin mal gespannt, was wir zwei Süßen da auf die Beine stellen können.

Übrigens lautet unser Team-Name: "Two Guys - One Cup"

An Diejenigen, die das nicht verstehen:

Bitte, bitte stellt keine Fragen und versucht nicht es herauszufinden ;)

An Diejenigen, die das verstehen:

Geil oder?!

 

Außerdem musste ich diese Woche mein Swapfiets-Vertrag kündigen, da eine Kündigungsfrist von einem Monat besteht.

Das heißt, ich gebe mein Rädchen am 20. Dezember - also an meinem letzten Arbeitstag - ab.

Bin so froh und erleichtert, dass das Rad fahren bisher (außer dem kleinen Unfall) so wunderbar geklappt hat.

Das Rad spart einem unheimlich viel Geld und man kommt überall schnell und unabhängig hin.

Richtig Gutes Zeug! Bin Swapfiets schon jetzt sehr dankbar.

 

Nun zur Arbeit!

Hauptprojekt (und das Spannendste zuerst):

 Also letzte Woche habe ich meine mit dem Aggrobakterium befallenen Pflänzchen "geerntet",

sie also abgeschnitten und komplett (bis auf die Wurzeln) in kleine Tüten verpackt und luftdicht abgeschlossen.

Dann kamen sie in einen Trockenraum zum Trocknen (wer hätte es gedacht).

Und heute habe ich dann die Samen von den Pflanzen selektiert.

Was bedeutet das?

Unser Aggrobakterium hat ja die DNA mit unserem CRISPR System in die Pflanzenzellen eingeschleust.

Das funktioniert aber natürlich nicht mit allen Zellen, sondern nur mit einer kleinen Minderheit.

Wie kann man jetzt aber beim Sortieren der Samen zwischen gentechnisch verändert und nicht verändert unterscheiden?

Man will ja nur die veränderten Samen ernten und weiterbenutzen!

Das funktioniert mit einem Trick:

Und zwar befindet sich auf der DNA, die vom Aggrobakterium in die Pflanzenzelle übertragen wird, ein RFP-Gen.

RFP steht für "rot fluoreszierendes Protein".

Und Fluoreszenz ist das, was zB Textmarker zum Leuchten bringt.

RFP ist also ein Protein, das bei Bestrahlung mit bestimmtem Licht, rot leuchtet (rot fluoresziert)!

Die Pflanzenzellen in den Samen der Pflanze unterscheiden sich also wie folgt:

Die nicht veränderten Samen leuchten nicht.

Die gentechnisch veränderten Samen stellen RFP her und leuchten rot.

Wie angesprochen, leuchten die Samen nur bei Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge.

Deshalb geht man mit seinen Samen zum Sortieren an ein Fluoreszenzmikroskop.

Das Fluoreszenzmikroskop bestrahlt die Samen dann mit dem Licht, das die rote Fluoreszenz anregt.

Dann kann man also die hell fluoreszierenden Samen mit einem Zahnstocher herauspicken!

Und genau das habe ich heute gemacht!

Die selektierten, veränderten Samen habe ich dann "stratifiziert".

Das bedeutet, ich habe sie auf ein feuchtes Papier gelegt, in einer Petrischale abgeschlossen,

die Petrischale mit Alufolie lichtdicht umhüllt und das Ganze dann in den Kühlschrank gestellt.

Dieser Prozess begünstigt das Keimen der Samen.

Nächsten Montag werden dann meine Mutenten-Pflanzen ausgesät.

Wie geht es jetzt weiter mit dem Hauptprojekt?

Ich muss nun wieder 3 - 4 Wochen warten, bis die Pflanzen groß genug sind, so dass ich Blätter ernten kann.

Anhand der Blätter kann ich dann die Pflanzen "genotypisieren", also deren Genotyp bestimmen.

Das heißt, man guckt ob durch unser eingefügtes CRISPR System auch tatsächlich Teile des Genoms herausgeschnitten wurden.

Genauere Erklärungen kommen dann, wenn es soweit ist.

Hoffentlich kommt es überhaupt so weit, weil die Uhr tickt und tickt!

Habe jetzt noch 4 Wochen im Labor, 

also beeilt euch meine lieben Pflänzchen!

 

Nebenprojekt 1:

Hier ging es diese Woche unfassbar schleppend voran, aber immerhin mit einem Happy End.

Eigentlich wollten wir ja einige unserer RNAs sequenzieren lassen, allerdings waren die analysierten Ergebnisse unserer

qPCRs nicht zufriedenstellend, so dass wir erst noch ein paar mehr Daten sammeln wollen.

Ich sollte also nochmals qPCRs ausführen - dieses Mal sollte die Expression des Little Ninja Gens untersucht werden.

Also habe ich aus der isolierten RNA noch mehr cDNA herstellen wollen.

Das hat dann auch reibungslos funktioniert.

Allerdings muss man die cDNAs anschließend verifizieren, bevor man sie in der qPCR einsetzt.

Da die cDNA die Gesamtheit aller exprimierten Gene einer Zelle darstellt, kann man cDNAs wie folgt verifizieren:

In der Zelle gibt es Gene, die ständig exprimiert werden, weil sie für die Vitalität der Zelle unersetzlich sind.

Man nennt diese Gene "Housekeeping" Gene.

Das heißt, mit absoluter Sicherheit beinhaltet die hergestellte cDNA auch ein Housekeeping Gen.

In einer "normalen" PCR versucht man dann genau dieses Gen aus der gesamten cDNA zu vervielfältigen.

Somit prüft man die cDNA auf Richtigkeit.

Ist die cDNA korrekt, kann man dann eine Gen-Bande für das Housekeeping Gen auf einem Gel ablesen.

Und das wollte einfach nicht funktionieren...

Ich hab zig Parameter getestet, an unterschiedlichen Stellschrauben gedreht.

Sogar Bin hat es versucht und er bekam auch keine Banden.

Aber heute am Freitag haben wir einfach mal einen anderen Puffer für die PCR genutzt, und siehe da: Es funktionierte!

(Siehe hierfür Bild 1 in der Gallerie)

Das heißt, unsere cDNAs sind jetzt verifiziert und nächste Woche geht es mit qPCRs weiter.

 

Nebenprojekt 2:

Hier lief es richtig gut!

Ich habe unsere neuen Konstrukte für die Proteinherstellung in die Bakterien transformiert.

Anschließend habe ich dann die Bakterien erneut unsere Proteine herstellen lassen, 

und siehe da:

Jetzt wurde auch das fehlende NINJA-Protein hergestellt.

Damit haben wir nun alle Proteine beisammen:

NINJA, JAZ und Little Ninja.

Allerdings haben wir diese Versuche nur in kleinem Maßstab ausgeführt.

Deswegen habe ich dann die Bakterienkulturgröße von 10 mL auf 150 mL erhöht und die Kulturen geerntet.

Nächste Woche werden wir die Proteine aus den geernteten Bakterien herauslösen.

Und dann kann es mit den Interaktionsstudien losgehen!

 

So lief also meine Woche!

Ganz schön intensiv, aber ich bin froh, dass ich hier gebraucht werde und einen kleinen Beitrag leisten kann.

Das ist ein schönes Gefühl.

Ich wünsche Euch ein tolles Wochenende.

Allehopp bis Moje!

Euer Kochi

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